了解一下該如何培養(yǎng)質(zhì)粒吧

 　　在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR322、pSC101。

　　pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有27種限制性內(nèi)切酶的單一識別位點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。

　　但是如果將DNA片段插入到Hind Ⅲ、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。

　　沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。

　　質(zhì)粒運載體的大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。

　　1973年，科學(xué)家將質(zhì)粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)。

　　常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。

　　pBR322質(zhì)粒DNA分子的長度為4361bp*(*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.)，此載體中有兩個標記基因，一個是氨芐青霉素抗性基因(Apr)，另一個是四環(huán)素抗性基因(Tetr)。已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限制酶的單一識別位點。

　　其中7種限制酶(從12:00位置按順時針方向)即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaⅢ和NruI的識別位點位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2 種限制酶即ClaI和HindⅢ的識別位點是存在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導(dǎo)致tetr的失活。

　　3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點插入外源DNA則會導(dǎo)致ampr基因的失活。由質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)可知其具有如下優(yōu)點:

　?、啪哂休^小的分子量。經(jīng)驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小好不要超過10Kb。pBR322質(zhì)粒這種小分子量的特點，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段;

　?、凭哂袃煞N抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

　　標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細胞。當(dāng)我們把一個DNA片段插入到某一個標記基因內(nèi)時，該基因就失去了相應(yīng)的功能。

　　當(dāng)把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細胞后，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉(zhuǎn)化細胞，細胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個標記基因。

　　另外，pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可積累1000~3000個拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。